Сканирующий конфокальный люминесцентный микроскоп Confotec CARS

3D Сканирующий лазерный микроскоп-спектрометр Confotec CARS

  • Пять каналов для одновременного сканирования
  • Три вида CARS измерений
  • Три режима сканирования
  • Высокая чувствительность
  • Высокая пространственное разрешение

Производитель SOL instruments

Описание
Характеристики

Преимущества CARS метода

  • высокая чувствительность: во время CARS процесса генерируются более сильные и направленные сигналы по сравнению с сигналами в спонтанной Рамановской микроскопии;
  • анти-Стоксов CARS сигнал имеет частоту, превышающую частоты волн накачки, и детектируется в спектральном диапазоне, свободном от мешающих засветок стоксовой люминесценции;
  • CARS сигнал генерируется только в фокусе, где интенсивность возбуждения является самой высокой. Это позволяет регистрировать изображения с высоким пространственным разрешением без использования конфокальных пинхолов, а также проводить 3D сканирование по слоям с минимальным влиянием соседних слоёв на результаты измерений;
  • спектральное разрешение CARS сигналов определяется только ширинами линий лазеров накачки, что позволяет упростить спектральные измерения, так как регистрация CARS сигналов может производиться без использования спектрального прибора;
  • CARS сигнал пропорционален квадрату концентрации молекул, что позволяет, наряду с селективностью и неинвазивностью метода, использовать CARS для количественных измерений концентрации химической субстанции в образце;
  • минимально инвазивная (бесконтактраная) техника CARS для биологических образцов. Благодаря высокой чувствительности, с помощью CARS метода молекулы в живых клетках можно регистрировать без флуоресцентных меток.

CARS сканирующий микроскоп. Высококонтрастное изображение

Полистереновые шарики различного диаметра
(F-CARS, 3045 cm-1)

Люминесцентный микроскоп. 3D CARS изображение структуры жидкого кристалла

3D CARS изображение структуры жидкого кристалла 8CB на резонансной частоте 2236 cм-1

Описание

Многофункциональность - Confotec CARS объединяет в единой системе:

  • CARS сканирующий микроскоп
  • Рамановский / люминесцентный сканирующий конфокальный микроскоп
  • традиционный сканирующий конфокальный лазерный микроскоп

Многоканальность – пять каналов для одновременных скоростных измерений:

  • F-CARS
  • E-CARS & Raman
  • отражённое лазерное излучение
  • прошедшее лазерное излучение
  • люминесцентное излучение

Ключевые особенности

Высокое пространственное разрешение:

CARS XYZ < 0.7 μм
Раман XY < 300 нм
Z   < 700 нм

 Широкой спектральный диапазон:

CARS 985 – 5000 см-1
Раман 75 – 6000 см-1

Высокое спектральное разрешение:

CARS 7 - 8 см-1
Раман 0.25 см-1

Рамановский микроскоп. Мультимодальное изображение клеток рака

Мультимодальное CARS/TPEF изображение растущих клеток рака HeLa: DNA/RNA/Proteins/Lipids цветное представление

Одновременный / многофункциональный анализ

  • построение высококонтрастных изображений с помощью CARS сигнала (не требуется предвари-тельных добавок в образцы)
  • построение конфокальных Рамановских изображений
  • построение конфокальных флуоресцентных изображений, включая двухфотонную (или мульти-фотонную) эмиссию
  • построение конфокальных изображений в отраженном лазерном излучении
  • построение высококонтрастных изображений в прошедшем лазерном излучении
  • визуализация профиля поверхности посредством генерации сигнала второй гармоники

Три вида CARS измерений

  • F-CARS
  • Е-CARS
  • P-CARS

Применение

  • Нанобиотехнологии: неинвазивный анализ биологических образцов (клеток и компонент живых клеток) и протекающих в них процессов в реальном времени и с высоким пространственным разрешением.
  • Исследования с применением микро- и нанотехнологий для изучения свойств микро-структур небиологической природы: полупроводники, жидкие кристаллы, полимеры, фармацевтические вещества, микро- и наночастицы.

Пять независимых скоростных каналов для регистрации до четырёх 2D и 3D изображений одновременно:

  • F-CARS: CARS сигнал в попутном (Forward) направлении
  • E-CARS & Raman: CARS сигнал в обратном (EPI) направлении / Raman сигнал
  • Reflected: сигнал отражённого лазерного излучения
  • Transmitted: сигнал прошедшего через образец излучения
  • Luminescent: люминесцентный сигнал
  • Поляризационное управление возбуждением и детектированием
  • Моноблочная лазерная система для возбуждения CARS сигналов
  • Дополнительный лазер 633нм для возбуждения стандартной однофотонной флуоресценции и спонтанного Рамановского рассеяния
  • Полностью автоматизированное управление: переключение режимов измерений путем автомати-ческого переключения необходимых компонентов внутри системы

Конфокальное изображение в отраженном лазерном излучении

Селективный имаджинг MIA-PaCa панкриатик человеческой раковой клетки для резонанса 2845 см -1 C-H связи (C-H aliphatic stretch). Селективная визуализация липидов

Три режима сканирования

  • сканирование лазерного луча по поверхности неподвижного образца с помощью XY сканнера
  • перемещение образца с помощью XY автоматизированного стола относительно неподвижного лазерного луча
  • комбинированный режим для получения панорамных изображений с высокой скоростью и высо-ким пространственным разрешением: XY сканнер + автоматизированный стол

Высокая точность калибровки по длинам волн: лучше ±0,002нм благодаря использованию встроенной калибровочной лампы в качестве источника реперных линий для автоматической оперативной калибровки монохроматора-спектрографа.

Блочная, жесткая, стержневая конструкция обеспечивает высокую временную и температурную стабильность

Конфокальное флуоресцентное изображение 3D клетки

3D изображение клетки

Интуитивно понятное программное обеспечение NanoSP®

  • Оперативное управление параметрами системы – полная автоматизация: переключение режимов измерений путем автоматического переключения необходимых компонентов внутри системы, управление шаттерами для выбора длины волны лазера возбуждения, контроль поляризации в канале возбуждения / регистрации, размер конфокального пинхо-ла, выбор решётки, установка центральной длины волны и выбор выходного порта моно-хроматора-спектрографа, подстройка положения пинхола и т.д.
  • Получение конфокальных 2D и 3D изображений: сканирование, накопление и сохранение данных.
  • Отображение CARS, Рамановских или люминесцентных спектров.
  • Различные методы калибровки спектров, в том числе с помощью встроенной калибровоч-ной лампы в качестве источника реперных линий.
  • 2-х/ 3-х мерное представление данных.
  • Обработка изображений:

- Коррекция изображений.

- Метрическая и статистическая обработка изображений, произвольные сечения.

- Цифровая фильтрация, изменение размеров и поворот изображения.

  • Обработка спектров:

- Вычитание широкополосного фона (background correction)

- Математические операции: сложение, вычитание, деление, произведение и т. д.

- Сглаживание несколькими способами

- Поиск и определение максимумов (пиков) спектральных линий

  • Режимы сканирования:

- Point

- XY

- XZ

- YZ

- XYZ

  • Способы сканирования:

- гальваносканер: 2D скоростные изображения

- гальваносканер + Piezo-Z сканер: 3D скоростные изображения

- автоматизированный стол: 2D изображения

- автоматизированный стол + Piezo-Z сканер: 3D изображения

- гальваносканер + автоматизированный стол: 2D панорамные изображения

- гальваносканер + автоматизированный стол + Piezo-Z сканер: 3D панорамные изображения

Технические характеристики

Пространственное XYZ разрешение CARS сигналов
(объектив 60х NA-1.2, водо-иммерсионный):
< 0.7 μм
Пространственное разрешение Рамановских сигналов
(длина волны лазера 633 нм; объектив 60х NA-1.2, водо-иммерсионный):
XY: < 300 нм
Z:   < 700 нм
Спектральный диапазон регистрации:

CARS сигналов:            985 – 5000 см-1
Рамановских сигналов: 75 – 6000 см-1

Спектральное разрешение: CARS сигналов:            7-8 см-1
Рамановских сигналов: 0.25 см-1(решетка 75 штр/мм Эшелле);
                                    0.6 см-1 (решетка 1800 штр/мм)
Диапазон скоростного сканирования (с объективом 60х) XY: 225 х 225 μм
Z:   80 μм
Управление: полная автоматизация

Оптический микроскоп

Тип: инвертированный
Модель: Nikon Ti-U
Стол: моторизованный
- диапазон перемещения: 114 х 75 мм
- точность (1мм перемещения): 0.06 μм
- XY воспроизводимость: ± 1 μм
- минимальный шаг перемещения стола: 0.02 μм
Микрообъективы: 60 х NA-1.2 водо-иммерсионный
20 x NA-0.45
Z-сканер:
- тип: пьезосканнер
- диапазон перемещения объектива: 80 μм
- минимальный шаг: 50 нм
- воспроизводимость: < 6 нм
Осветитель для работы в отраженном свете: галогеновая лампа 100 Вт
Осветитель для работы в проходящем свете: светодиодный
Ввод лазерного излучения: трехпозиционная автоматизированная турель
Цифровая видеокамера высокого разрешения:
- тип: цифровая цветная ПЗС-камера
- сенсор: 1/2", 2048 x 1536 пикселей
- АЦП: 10 бит, скорость 12 кадров/сек

Лазер для возбуждения CARS сигналов.

Моноблочная Оптическая Параметрическая Система в составе:
Пикосекундный твердотельный Nd:YVO4 лазер
Длина волны излучения: 1064 нм
Длительность импульса: 6.5 пс
Выходная мощность: 6 Вт
Частота повторения импульсов: 85 МГц
Модовый состав: TEM00
Качество пучка (М2): < 1.5
Диаметр пучка: 2 мм
Перестраиваемый SOPO
(Synchronously pumped Optical Parametrical Oscillator)
Диапазон длин волн: 690 - 990 нм
Выходная мощность: > 400 мВт (800 нм)
Длительность импульса: 5 - 6 пс
Частота повторения импульсов: 85 МГц
Поляризация: горизонтальная
Модовый состав: TEM00
Качество пучка (М2): < 1.2
Диаметр пучка: 2 мм
Встроенная оптическая линия задержки

 Лазер для Рамановской спектроскопии

Тип лазера: CW HeNe
Длина волны излучения: 632.8 нм
Средняя мощность: > 10 мВт
Поляризация: линейная
Диаметр пучка: 0.65 мм
Расходимость пучка: < 1.24 мрад

Модуль формирования и совмещения лазерных пучков

Лазерные затворы: 3 (Nd:YVO4 лазер, SOPO и HeNe лазер)
Поляризатор: 2 (Nd:YVO4 лазер и SOPO)
Фазовая пластинка λ/2 2 (Nd:YVO4 лазер и HeNe лазер)
Вариотелескоп: 3 (Nd:YVO4 лазер, SOPO и HeNe лазер)

Оптический модуль

Оптика, оптимизированная для спектрального диапазона: 400 - 1100 нм
Анализатор: призма Глан-Тэйлора
Ослабитель лазерного излучения: нейтральный фильтр переменной плотности 0 - 3D
Позиционер предпинхольного объектива: трехкоординатный (X, Y, Z)
Позиционер CARS, Рамановских и флуоресцентных фильтров: пятипозиционный
Позиционер дихроичных фильтров: шестипозиционный

Монохроматор-спектрограф изображения MS 5004i

520 мм

Схема сканирующего микроскоп-спектрометра Confotec CARS