Хемилюминесценция: метод, применения и оборудование

Хемилюминесценция — испускание света веществом в результате химической реакции, без внешнего возбуждающего излучения. Метод даёт чувствительность 10⁻¹⁵–10⁻¹⁸ моль и линейный диапазон 5–7 порядков — значительно выше абсорбционных и флуоресцентных методик. На этом принципе построены клинические иммуноанализаторы CLIA и ECLIA (онкомаркеры, гормоны, кардиомаркеры), ATP-биолюминесцентный гигиенический контроль, оценка активных форм кислорода и оксидативного стресса, экологический мониторинг хлора, озона, NOₓ и пероксидов в воде и воздухе, криминалистические люминольные тесты следов крови, фарм-контроль эндотоксинов и микотоксинов.

Ниже в статье: описание метода, его подвидов (прямая реакция, биолюминесценция, электрохемилюминесценция), типового оборудования и доступных в каталоге приборов — в первую очередь спектрофлуориметра СМ 2203 (ЗАО «СОЛАР»), совмещающего хемилюминометрию с флуориметрией, фотометрией и фосфориметрией.

Ключевые особенности:

• Без внешнего возбуждающего излучения — нет рассеянного света и автофлуоресценции; «чёрный» сигнал соответствует нулевой концентрации.
• Кинетический режим — характеристическая форма световой кривой даёт второй уровень специфичности.
• 3 подвида: прямая реакция, биолюминесценция (БЛ), электрохемилюминесценция (ECL).
• Простая аппаратура: затемнённый кюветный отсек + ФЭУ + регистрирующая электроника.
• Совместимость с микропланшетами, проточными ячейками, биосенсорами, иммуноанализаторами.
• Стандартный метод в клинической биохимии (анализаторы Roche, Abbott, Beckman).
• Газофазная реакция NO + O₃ — основа атмосферных NOₓ- и O₃-анализаторов EPA-стандарта.
• Совместимость с многофункциональными приборами типа спектрофлуориметра СМ 2203 — программный режим «Кинетика FF», магнитная мешалка, термостат 10–60 °С.

Области применения

Метод применяется в десятках областей — от рутинной клинической диагностики до фундаментальной биохимии и атмосферного мониторинга. Ниже — основные сферы с указанием объектов и типичных пользователей.

Иммунохимический анализ — CLIA, ECLIA, ECL

Доминирующая область клинической практики: гормоны (ТТГ, Т3/Т4, ФСГ/ЛГ, эстрадиол, тестостерон, ХГЧ, кортизол), онкомаркеры (ПСА, РЭА, СА 125, СА 19-9, АФП), кардиомаркеры (тропонин, BNP, миоглобин), серология инфекций (HBsAg, anti-HCV, anti-HIV, ковид-IgG/IgM), витамины (25-OH витамин D, B12, фолиевая). Платформа Roche Cobas использует рутений-комплекс Ru(bpy)₃²⁺ как ECL-метку.

ATP-биолюминесценция и гигиенический контроль

Реакция люциферин + АТФ + люцифераза → свет (562 нм) — универсальный маркер живых клеток. Применяется для контроля чистоты поверхностей пищевых производств, общепита, больниц (HACCP), оценки микробиологической обсеменённости продуктов и воды, скрининга антибиотиков, цитотоксичности in vitro (CellTiter-Glo), мониторинга биомассы в биореакторах фарм-биотехнологии.

Активные формы кислорода и оксидативный стресс

Люминол + ROS + катализатор → 425 нм — оценка «дыхательного взрыва» нейтрофилов и макрофагов. Люцигенин (480 нм) — селективный детектор супероксида O₂•⁻. MCLA, FCLA, CLA — зонды на синглетный кислород ¹O₂. Применяется в исследованиях NADPH-оксидазной активности, антиоксидантной ёмкости пищевых продуктов (TAC), диагностике септического воспаления, фотодинамической терапии онкологии.

Фагоцитарная и иммунологическая активность

Свечение нейтрофилов и моноцитов с зимозаном, opsonized E. coli, PMA, fMLP — золотой стандарт оценки кислород-зависимого киллинга. Диагностический тест хронической гранулематозной болезни (ХГБ). Скрининг иммуномодуляторов (тактивин, левамизол), оценка опсонизирующей активности сывороток, бактерицидной активности антибиотиков.

Контроль качества воды и экологический мониторинг

Люминол + ClO⁻ — определение остаточного хлора в питьевой и очищенной воде (ПДК 0,3–0,5 мг/л). Озон в озонаторных установках. Пероксид водорода в дезинфектантах. Тяжёлые металлы (Cr⁶⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Mn²⁺) через ингибирование люминесцентной реакции. NO в выдыхаемом воздухе и атмосфере (FeNO-тест в пульмонологии).

Электрохемилюминесценция (ECL) и биосенсоры

ECL-биосенсоры с функционализированными электродами и Ru(bpy)₃²⁺-меткой: мультиплексные тесты на онкомаркеры, инфекции, токсины. PCR-усиленная ECL для ДНК/РНК. ECL-иммунохроматография для микотоксинов. Платформы MSD QuickPlex, Roche Cobas — основа современной in vitro диагностики.

Криминалистика и судебная экспертиза

Люминольный тест: люминол + H₂O₂ + Fe-гем гемоглобина → 425 нм; чувствительность 1:1 000 000 — обнаружение замытых следов крови. Анализ нитритов и нитратов после взрывных следов. ATP-тест на возраст биологических следов. ECL-варианты определения наркотиков в биожидкостях.

Газофазные методы в атмосферном мониторинге

NO + O₃ → NO₂* → испускание света — стандартный метод EPA для атмосферного мониторинга оксидов азота. Озон через реакцию с этиленом или NO. SO₂ через газофазную реакцию с озоном (предел 50 ppt). FeNO-тесты для диагностики эозинофильного воспаления при бронхиальной астме (ATS/ERS-стандарт).

Биолюминесценция в фундаментальных исследованиях

Репортёрные конструкции с геном люциферазы — количественная оценка промоторной активности. In vivo биолюминесцентная визуализация (IVIS) — отслеживание опухолей, бактериальных инфекций в живых животных. Aequorin — Ca²⁺-биосенсор в нейробиологии. Lux-биосенсоры на стресс-промоторы (sosA, recA) — детектирование генотоксикантов.

Промышленный контроль и фарм-производство

LAL-тест и recombinant Factor C — обязательный контроль эндотоксинов в инъекционных ЛС (Endosafe, кинетический формат). ECL-иммуноанализ микотоксинов в кормах и продуктах. Контроль пирогенности готовых ЛС (фармакопейная процедура). ATP-мониторинг биомассы в биореакторах антибиотиков и рекомбинантных белков.

Конструкция и принцип работы

Принцип метода прост: при химической реакции часть энергии выделяется не как тепло, а как свет — продукт оказывается в электронно-возбуждённом состоянии и переходит в основное с испусканием фотона. Аппаратура минимальна: затемнённое отделение с кюветой (или ячейкой проточного типа), фотоумножитель в режиме счёта фотонов или аналогового интегрирования сигнала, регистрирующая электроника. В отличие от флуориметрии, не требуется монохроматор возбуждения, источник света, оптическая схема двойного монохроматора. Однако спектральное разрешение испускаемого света даёт дополнительную информацию (идентификация механизма реакции) — поэтому многофункциональные приборы вроде спектрофлуориметра СМ 2203 поддерживают режим «спектр свечения» через монохроматор регистрации, при отключённом возбуждении. Для типовых количественных задач используется интегральный сигнал (общий «выход света») или кинетика — регистрация интенсивности от времени с миллисекундным шагом. Электрохемилюминесценция (ECL) добавляет к схеме ячейку с электродами; стимуляция реакции напряжением даёт высокую воспроизводимость и автоматизацию.

Технические характеристики прибора:

• Источник возбуждения: Не требуется (свет — продукт реакции)
• Чувствительность 10⁻¹⁵ – 10⁻¹⁸ моль (атто-фемтомоль)
• Линейный диапазон 5–7 порядков концентраций
• Спектральная область реагентов 425–700 нм (типично)
• Люминол 425 нм (синий)
• Изолюминол 460 нм
• Люцигенин 480 нм
• Акридиниум-эфиры 430 нм (вспышка)
• Оксалатные эфиры (peroxyoxalate) 500–700 нм (через флуоресцентный сенсибилизатор)
• Ru(bpy)₃²⁺ (ECL) 620 нм
• Светлячковая люцифераза 562 нм (биолюминесценция)
• Aequorin (Ca²⁺-индикатор) 470 нм
• Газофазная NO+O₃ 600–875 нм
• Регистрация ФЭУ, лавинный фотодиод, ПЗС-камера (имиджинг)
• Подвиды Прямая хемилюминесценция, биолюминесценция (ферментативная), ECL (электрохимическая)
• Стандарт в клинике CLIA, ECLIA (Roche, Abbott, Beckman, Siemens)

Как выбрать модель и источник

Для большинства научно-исследовательских и контрольно-аналитических задач (NIH-, фарм-R&D, эколаборатории, учебные практикумы) достаточно стационарного спектрофлуориметра с режимом хемилюминесцентных измерений — например, СМ 2203. Для рутинной клинической диагностики нужен автоматический иммуноанализатор. Для атмосферного мониторинга NOₓ — специализированный газовый детектор. Для фундаментальных исследований кинетики реакций — ФЭУ-стенд с быстрым stopped-flow смешивающим устройством. Под конкретную задачу пришлите параметры (аналит, концентрационный диапазон, формат пробы) — наши специалисты подберут оптимальное решение.

Комплектация и опции

• Спектрофлуориметр СМ 2203 (ЗАО «СОЛАР») — режим «Кинетика FF» + спектр свечения через монохроматор регистрации; в комплекте магнитная мешалка для смешивания реагентов и термостатируемый кюветный держатель 10–60 °С.
• Кварцевая кювета КУ-1 — обязательная для УФ-реагентов; одноразовые полистирольные кюветы — для рутинного скрининга.
• Магнитные одноразовые якори (200 шт. в комплекте СМ 2203) — стартовое смешивание реагентов прямо в кювете.
• ГСО состава раствора фенола (РБ 605-02 / РФ 7346-96) — для поверки чувствительности тракта.
• Программное обеспечение «Универсал» (СМ 2203) — окна «Кинетика FF», «Спектр», «Расписание задач» для автоматизации серий.
• Приставка для подачи реагента шприцом или перистальтическим насосом РР 1251 — опция к СМ 2203 для start-injection методик.

Преимущества

• Полный охват метода в одном решении. СМ 2203 совмещает четыре режима: хемилюминометрию, флуориметрию, фотометрию и фосфориметрию — в едином ПО.
• Госреестр СИ РФ № 33844-25. Прибор аттестован как средство измерений; допуск в бюджетные учреждения, госповерка, ТЗ по 44-ФЗ и 223-ФЗ.
• Высокая чувствительность тракта. ФЭУ R928 и режим счёта фотонов — детектирование на пределе субнаномоля для большинства реагентов свечения.
• Специализированное ПО. Окно «Кинетика FF» с миллисекундным шагом, расписание задач для автоматизации серий, экспорт в MS Excel/Word для отчётов.
• Полный сервис ООО «Промэнерголаб». Пусконаладка, обучение, методическая поддержка, поставка ГСО и расходников со склада в Москве.

Поставка, гарантия, сервис

• Срок поставки СМ 2203: от 14 дней при наличии на складе; стандартный срок изготовления на заказ — около 3 месяцев.
• Гарантия 12 месяцев с момента ввода в эксплуатацию.
• Шеф-монтаж и пусконаладка на площадке заказчика.
• Обучение специалистов методике на ваших образцах (1–2 дня).
• Методическая поддержка в адаптации фармакопейных и собственных методик.
• Работа по 44-ФЗ и 223-ФЗ — полный пакет документов для бюджетных закупок.
• Поставка расходников (кюветы, якори, ГСО) со склада в Москве.

Заказать

Опишите задачу: тип объекта (биожидкость, вода, газ, поверхность), аналит, желаемая чувствительность, формат измерения (точечный, кинетический, спектральный) — подберём оборудование, согласуем методику, рассчитаем стоимость с учётом 44-ФЗ/223-ФЗ. По хемилюминесценции в наличии: спектрофлуориметр СМ 2203. Ответим в течение одного рабочего дня.

Вопросы и ответы (FAQ)

Общие вопросы о методе

Что такое хемилюминесценция?

Это испускание света веществом в результате химической реакции, без внешнего возбуждающего излучения. Часть энергии реакции выделяется не как тепло, а как фотон. По чувствительности (10⁻¹⁵–10⁻¹⁸ моль) метод опережает большинство абсорбционных и флуоресцентных методик. На этом принципе построены клинические иммуноанализаторы, ATP-биолюминесцентный гигиенический контроль, атмосферные NOₓ-анализаторы.

Чем метод отличается от флуоресценции?

Флуоресценция требует внешнего источника света: молекула поглощает фотон, переходит в возбуждённое состояние и затем испускает фотон с большей длиной волны. Здесь же энергия для возбуждения молекулы получается из самой химической реакции. Из-за отсутствия рассеянного возбуждающего света фон в измерениях минимален, что даёт чувствительность на 2–4 порядка выше флуориметрических методов.

Какие подвиды метода существуют?

Три основных подвида. (1) Прямая реакция — обычная химическая реакция с возбуждённым продуктом (люминол, изолюминол, оксалатные эфиры, акридиниум). (2) Биолюминесценция (БЛ) — ферментативная реакция, где катализатор — люцифераза (свет в реакции люциферина с АТФ или O₂); основа ATP-метров и репортёрных систем. (3) Электрохемилюминесценция (ECL) — реакция инициируется на электроде; основа автоматических иммуноанализаторов Roche Cobas.

Какова чувствительность метода?

Типичная чувствительность — 10⁻¹⁵ моль (фемтомоль) для прямых реакций, до 10⁻¹⁸ моль (аттомоль) для усиленных систем (ферментативное усиление, ECL, фотонное счётное детектирование). Линейный диапазон обычно 5–7 порядков концентраций — это позволяет работать с биологическими образцами без предварительного разбавления. Для сравнения: классическая абсорбционная фотометрия работает в диапазоне 10⁻⁵–10⁻⁷ моль и линейности 2–3 порядка.

Применения и методики

Где применяется метод в клинической диагностике?

Доминирующая область — иммунохимический анализ (CLIA, ECLIA). Гормональные панели (ТТГ, Т3/Т4, ФСГ/ЛГ, эстрадиол, тестостерон, кортизол, ХГЧ), онкомаркеры (ПСА, РЭА, СА 125, СА 19-9, АФП), кардиомаркеры (тропонин I/T, BNP, миоглобин), серология инфекций (HBsAg, anti-HCV, anti-HIV, ковид-IgG/IgM), витамины (25-OH витамин D, B12). Стандартные платформы — Roche Cobas (Ru(bpy)₃²⁺-метка), Abbott ARCHITECT, Beckman UniCel.

Что такое ATP-биолюминесценция и зачем она нужна?

Это ферментативная реакция: люциферин + АТФ + люцифераза светлячка → оксилюциферин + AMP + PPi + свет 562 нм. Поскольку АТФ есть во всех живых клетках, метод работает как универсальный маркер живых организмов. Применяется для контроля чистоты поверхностей в пищевой промышленности (HACCP), медицине, фармацевтике; быстрая оценка микробиологической обсеменённости (15–60 секунд против 24–48 часов на классический посев); скрининг антибиотиков; цитотоксичность in vitro. 7. Применение в криминалистической экспертизе Основной инструмент — люминольный тест на следы крови. Гем гемоглобина катализирует реакцию люминола с пероксидом водорода → 425 нм; чувствительность 1:1 000 000 позволяет обнаруживать замытые следы спустя месяцы и годы. Дополнительно: преципитиновые тесты для верификации, анализ нитритов и нитратов от взрывчатых веществ, ATP-тесты на возраст биологических следов, ECL-методы определения наркотиков в биожидкостях. Используется в экспертных подразделениях МВД, СКР, Минюста.

Можно ли измерить активные формы кислорода (ROS) этим методом?

Да, это одно из основных применений. Люминол (425 нм) реагирует с большинством ROS при наличии катализатора (HRP, гемоглобин, ионы металлов) — оценивает «дыхательный взрыв» нейтрофилов. Люцигенин (480 нм) — селективный детектор супероксида O₂•⁻. MCLA, FCLA, CLA — зонды на синглетный кислород ¹O₂. Применяется в исследованиях оксидативного стресса при ишемии, диабете, нейродегенеративных заболеваниях; в фотодинамической терапии онкологии; для оценки антиоксидантной ёмкости пищевых продуктов (TAC).

Подходит ли метод для контроля воды и сточных вод?

Да. Стандартные методики: люминол + ClO⁻ для определения остаточного хлора (ПДК 0,3–0,5 мг/л); озон через реакцию с эозином или родамином; пероксид водорода в дезинфектантах; косвенное определение тяжёлых металлов (Cr⁶⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Mn²⁺) через ингибирование стандартных реакций; анализ NO в воде и атмосфере. Используется в водоканалах, аккредитованных эколабораториях Росводресурсов и Роспотребнадзора, на очистных сооружениях.

Оборудование для хемилюминесценции

Какое оборудование нужно для таких измерений?

В минимуме: затемнённый кюветный отсек, фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) или лавинный фотодиод в режиме счёта фотонов, регистрирующая электроника. В отличие от флуориметрии, не нужны источник света, монохроматор возбуждения, поляризатор. Для рутинных задач удобны мультиметодные приборы (например, спектрофлуориметр СМ 2203 с режимом «Кинетика FF» и магнитной мешалкой). Для клинического иммуноанализа — автоматические CLIA/ECLIA-анализаторы. Для атмосферного NOₓ — специализированные газовые детекторы свечения.

Подходит ли спектрофлуориметр СМ 2203 для этих задач?

Да. СМ 2203 (производство ЗАО «СОЛАР») поддерживает режим хемилюминесцентных измерений через окно «Кинетика FF» программного обеспечения «Универсал». Магнитная мешалка с одноразовыми якорями (200 шт. в комплекте) позволяет смешать реагенты прямо в кювете и зарегистрировать кинетику с миллисекундным шагом. Термостатирование 10–60 °С даёт стабилизацию реакции. Дополнительно: спектр свечения через монохроматор регистрации (при отключённом возбуждении) — идентификация механизма реакции.

Чем хемилюминометр отличается от флуориметра?

Хемилюминометр — узкоспециализированный прибор без источника возбуждения и монохроматора возбуждения; имеет только ФЭУ в затемнённом отсеке. Дешевле и компактнее. Флуориметр имеет полную оптическую схему — источник (Xe-лампа), монохроматор возбуждения, кюветный отсек, монохроматор регистрации, ФЭУ. Многофункциональные приборы (например, СМ 2203) включают оба режима: при включенной лампе работают как флуориметр, при выключенной — как хемилюминометр. Универсальность за счёт небольшого усложнения схемы.

Можно ли получить спектр свечения?

Да, если прибор имеет монохроматор регистрации. На СМ 2203 поддерживается режим «Спектр» — сканирование с выключенным возбуждением. Это полезно для идентификации продукта возбуждённого состояния: разные реагенты имеют характерные λmax (425 нм люминол, 480 нм люцигенин, 562 нм светлячковая БЛ, 620 нм Ru(bpy)₃²⁺). Для типовых количественных задач спектр не нужен — достаточно интегрального сигнала или кинетики.

Технические нюансы

Какая температура нужна для реакций свечения?

Большинство реакций ускоряются при нагревании, но скорость растёт нелинейно — при 37–45 °С достигается оптимум интенсивности и устойчивости, при более высоких температурах быстро падает квантовый выход за счёт безызлучательной диссипации. Биолюминесцентные системы (люцифераза светлячка) требуют комнатной температуры или 25–30 °С — выше денатурирует фермент. Поэтому термостатирование кюветного держателя — критически важная функция. На СМ 2203 поддерживается диапазон 10–60 °С с шагом 0,1 °С.

Какие реагенты используются в методе?

Для прямой реакции — люминол (3-аминофталгидразид), изолюминол, акридиниум-эфиры (CSPD, CDP-Star), оксалатные эфиры (peroxyoxalate, бис-(2,4,6-трихлорофенил)оксалат), люцигенин (5,5′-диметилдиакридиний). Для биолюминесценции — люциферин-люциферазные пары (светлячок Photinus pyralis, бактерии Vibrio fischeri, грибы Mycena). Для ECL — рутений-комплексы Ru(bpy)₃²⁺ с трипропиламином в качестве со-реагента. Реагенты обычно требуют холодильного хранения и подготовки рабочих растворов в день эксперимента.

Как выбрать реагент под задачу?

Реагент-зависимая селективность — главный фактор. Для активных форм кислорода: люминол (общий ROS), люцигенин (специфичен на супероксид), MCLA/FCLA (синглетный кислород). Для иммуноанализа: акридиниум-эфиры, люминол с HRP-меткой, ECL с Ru(bpy)₃²⁺. Для анализа АТФ: люцифераза-люциферин (только для АТФ). Для пероксида и гипохлорита: люминол + Co²⁺/Cu²⁺. Реагент определяет аналит — поэтому методики из научной литературы переносятся напрямую только при сохранении пары «реагент–аналит».

Каковы типичные времена кинетических измерений?

Кинетический профиль зависит от типа реакции. (1) Вспышечные (flash) реакции — акридиниум-эфиры, миллисекундный пик, общая длительность секунды; нужен быстрый старт-инжектор. (2) Свечение (glow) реакции — люминол с пероксидазой, медленное нарастание и плато 5–30 минут; не требует быстрой регистрации. (3) Биолюминесценция светлячка — относительно стабильное свечение 10–60 минут после смешивания. На СМ 2203 в режиме «Кинетика FF» можно установить шаг от 10 мс до часов и общую длительность измерения до 24 часов.

Эксплуатация и сервис

Нужна ли калибровка прибора?

Да. Для количественных измерений необходимы стандартные образцы или вещества-стандарты люминесценции. Распространённые стандарты — стандартный раствор флуоресцеина (для проверки чувствительности тракта), люминольный раствор с известным квантовым выходом, светлячковый ATP-стандарт. На СМ 2203 для поверки используется ГСО состава раствора фенола (ГСО РБ 605-02 / ГСО РФ 7346-96) и комплект светофильтров КСС-04. Межповерочный интервал — обычно 1 год; первичная поверка — на заводе с подтверждением свидетельством.

Можно ли проводить измерения при дневном свете?

Кюветное отделение прибора должно быть закрыто крышкой во время измерения — любая утечка света во много раз превышает полезный сигнал. Подготовку реагентов и проб можно выполнять при обычном лабораторном освещении. Для особо чувствительных задач (биолюминесценция, фотон-счётный режим) рекомендуется приглушённое освещение в лаборатории. На СМ 2203 кюветный отсек штатно закрывается светонепроницаемой крышкой; индикаторный светодиод на передней панели не влияет на измерения.

Коммерческие вопросы

Какие приборы для хемилюминесценции есть в каталоге czl.ru?

Основная позиция: спектрофлуориметр СМ 2203 (производство ЗАО «СОЛАР») с режимом «Кинетика FF» и спектром свечения. Прибор имеет Госреестр СИ РФ и поставляется по 44-ФЗ/223-ФЗ. Для специализированных задач (планшетные ридеры, газовые NOₓ-анализаторы, клинические CLIA-анализаторы) — пришлите параметры Вашей задачи.

Как заказать оборудование?

Опишите задачу: тип объекта (биожидкость, вода, газ, поверхность, твёрдый образец), целевой аналит, требуемая чувствительность, ожидаемый формат измерения (точечный / кинетический / спектр / микропланшет). На основе этих параметров мы подберём оптимальную конфигурацию, согласуем методику измерений, рассчитаем стоимость с учётом 44-ФЗ/223-ФЗ. Срок ответа — 1 рабочий день. 

Можно ли провести демонстрацию метода на наших образцах?

Да. В демонстрационном зале ООО «Промэнерголаб» в Москве можно увидеть СМ 2203 в работе и провести тестовые измерения на ваших пробах. По предварительному согласованию мы протестируем вашу конкретную задачу — это позволит оценить применимость прибора до закупки.