Спиновые ловушки, метки и зонды: определение свободных радикалов методом ЭПР

Спиновая метка, спиновый зонд и спиновая ловушка — три способа привнести в исследуемую систему стабильный парамагнитный центр и наблюдать её методом ЭПР. Метод спиновых ловушек предложен E. G. Janzen в 1970-е годы: короткоживущий радикал присоединяется к диамагнитной ловушке, а неспаренный электрон сохраняется в более стабильном продукте — спиновом аддукте, который живёт часами и потому доступен для измерения. Спектры аддуктов регистрирует ЭПР-спектрометр ESR5000 (прежнее название — Magnettech MiniScope MS 5000; поставщик в РФ — Промэнерголаб): рабочая частота 9,2–9,6 ГГц, чувствительность 5×10¹³ спин/Тл. Области, где это работает, охватывают анализ клеточных структур, живых тканей и прямые измерения в организме млекопитающего (Kuppusamy et al. (2001) Magn. Reson. Med. 45, 700–707).

Ключевые особенности

• Спиновое улавливание. Короткоживущий радикал переводится химической ловушкой в стабильный аддукт, который затем измеряется методом ЭПР. Ловушка обладает избирательностью, поэтому один вид радикалов регистрируется на фоне остальных.
• Спиновое зондирование. Стабильный радикал вводится в живую систему или химическую структуру; по форме его линии определяют скорости диффузии, микровязкость и химическое окружение.
• Спиновая маркировка. Стабильный радикал ковалентно пришивается к биомолекуле; наблюдают молекулярную структуру, конформационную подвижность и механизм реакции.
• Идентификация ведётся по сверхтонкой структуре аддукта. Аддукт DMPO-OH с гидроксильным радикалом даёт квартет с соотношением интенсивностей 1:2:2:1 и константами a_N ≈ a_H ≈ 1,49 мТл.
• Аддукт DMPO-OOH с супероксид-анион-радикалом различается по числу линий и константам: a_N ≈ 1,42 мТл, a_H^β ≈ 1,14 мТл, a_H^γ ≈ 0,125 мТл. Разные константы для двух активных форм кислорода и позволяют разделить их в одной пробе.
• Количественная оценка выполняется двойным интегрированием сигнала со сравнением с эталоном спиновой концентрации — измеряется не только какой радикал образовался, но и сколько.
• ЭПР-оксиметрия: молекулярный кислород парамагнитен, его столкновения с нитроксильным зондом уширяют линию. По ширине линии зонда определяют локальное парциальное давление кислорода в ткани или суспензии клеток.
• ESRStudio выполняет автоматическую подстройку, измерение и расчёт, поддерживает пользовательские скрипты и готовые методики — в том числе измерение NO.

 
Вид окна программы ESRStudio: измерение NO

Назначение и области применения

ЭПР в биологии и медицине решает одну общую задачу — зарегистрировать частицу, которая живёт микросекунды и не видна оптическими методами. Ниже — направления, где метод спиновых ловушек даёт результат, недостижимый косвенными методиками.

Измерение супероксид-радикала в клетках

Продукция супероксида регулируется специфическими веществами-мессенджерами; в работе Dikalov et al. (2004) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C899–C905 анализ на ЭПР показал снижение выхода супероксида в эндотелиальных клетках при соответствующем воздействии, а также прямую связь с биодоступностью оксида азота. Измеряется скорость генерации активных форм кислорода конкретной клеточной культурой, а не суммарный «антиоксидантный статус». Кому: лаборатории редокс-биологии, кардиологические и фармакологические НИИ.

Гидроксильный радикал и реакция Фентона

Движущая сила генерации ·ОН в организме — восстановленные ионы металлов переменной валентности. Реакция Фентона записывается как H₂O₂ + Fe²⁺ → ·OH + OH⁻ + Fe³⁺; механизм для Fe²⁺- и Cu⁺-содержащих систем разобран в работе Beresewicz, Urbanski (2000) Acta Biochimica Polonica 47, 951–962. Процесс критически зависит от доступности O₂, а добавление восстановителей усиливает генерацию радикалов. Регистрация ведётся по аддукту DMPO-OH. Кому: биохимические лаборатории, исследования токсичности тяжёлых металлов, разработка хелаторов.

Определение оксида азота (NO) методом ЭПР

Оксид азота улавливают в парамагнитный нитрозильный комплекс: свободный NO даёт слишком короткоживущий сигнал. Обзор направления — Daiber (2015) Int. J. Mol. Sci. 16, 15918–15953; типовой объект — образование оксида азота в изолированных сегментах аортального кольца у мышей дикого типа. Структура нитрозильного комплекса гема (NO-heme) предложена А. Клещёвым. Кому: физиология сосудов, кардиофармакология, исследования эндотелиальной дисфункции.

Возникновение NO в сердечно-сосудистой системе:
Daiber (2015) Int. J. Mol. Sci. 16, 15918 – 15953

Формирование оксида азота в изолированных сегментах аортального кольца у мышей дикого типа

Структура NO-heme aus, предложенная А. Клещевым

Окислительный стресс в тканях и на живом животном

Протокол работы со спиновой ловушкой на живой мыши (Pfeiffer et al. (2003) J. Clin. Invest. 112, 527–534) состоит из четырёх шагов: смешать раствор из коммерческих буферов и спиновой ловушки DMPO; ввести несколько миллилитров в область образца; инкубировать 45 мин при 37 °C; извлечь раствор, заполнить капилляр и запустить измерение. Подстройка, регистрация и расчёт идут автоматически, оператору остаётся интерпретация спектра. Кому: доклинические лаборатории, исследования ишемии и реперфузии.

Спиновые метки и зонды в структурной биологии

Нитроксильный радикал, пришитый к белку или липиду, сообщает о своём окружении анизотропией спектра: по времени корреляции вращения определяют подвижность участка цепи, по параметру порядка — текучесть мембраны. Тот же приём измеряет микровязкость, локальный pH и кислород. Кому: биофизические лаборатории, мембранология, разработка липидных систем доставки.

Скрининг антиоксидантов и защитных составов

Радикал-генерирующая система задаёт постоянный поток активных форм кислорода, испытуемое вещество его подавляет, а ЭПР измеряет остаточную концентрацию аддуктов. Так оценивают фактор защиты от радикалов в косметике и солнцезащитных составах. Кому: R&D косметических и фармацевтических производств.

Конструкция и принцип работы

Что именно измеряется. Короткоживущий радикал R· присоединяется к нитронной ловушке по двойной связи; неспаренный электрон локализуется на нитроксильной группе образовавшегося аддукта, а уловленный фрагмент оказывается на соседнем β-углероде. Отсюда следует главное свойство метода: спектр аддукта содержит константу сверхтонкого взаимодействия с ядром азота (a_N) и с β-протоном (a_H^β), и именно вторая зависит от того, какой радикал был уловлен. Поэтому спектр читается как отпечаток: квартет 1:2:2:1 с a_N ≈ a_H ≈ 1,49 мТл — уловлен ·ОН, набор линий с a_N ≈ 1,42, a_H^β ≈ 1,14 и a_H^γ ≈ 0,125 мТл — супероксид; константы сверяются с опубликованными базами аддуктов. Количественная часть — двойное интегрирование сигнала и сравнение с эталоном спиновой концентрации. Кинетику строят по серии спектров: так измеряют скорость генерации этих частиц, а не только конечную концентрацию.

Метод спинового улавливания был представлен в 1970-е годы E.G. Janzen. Основным принципом метода является сохранение неспаренного электрона короткоживущего радикала путем образования более стабильного радикала:

Технические характеристики

• Объект: Ловушка или метка · Признак в спектре
• Гидроксильный радикал ·ОН: DMPO · Аддукт DMPO-OH: квартет 1:2:2:1, a_N ≈ a_H ≈ 1,49 мТл
• Супероксид-анион-радикал O₂·⁻: DMPO · Аддукт DMPO-OOH: a_N ≈ 1,42 мТл, a_H^β ≈ 1,14 мТл, a_H^γ ≈ 0,125 мТл
• Углеродцентрированные радикалы в водной среде: POBN · Долгоживущие аддукты; применяется в анализе напитков и пищевых матриц
• Супероксид с увеличенным временем жизни аддукта: DEPMPO · Фосфорилированный аналог DMPO, аддукт распадается медленнее, чем DMPO-OOH
• Оксид азота NO: Железо-дитиокарбаматные комплексы, гем · Парамагнитный нитрозильный комплекс с характерной сверхтонкой структурой на ядре азота
• Подвижность белка и мембраны: Нитроксильная спиновая метка · Анизотропия спектра, время корреляции вращения
• Парциальное давление кислорода: Нитроксильный спиновый зонд · Уширение линии за счёт столкновений с молекулярным кислородом
• Количество радикалов: Эталон спиновой концентрации · Двойное интегрирование сигнала и сравнение с эталоном

Как выбрать методику под объект

По типу вводимого парамагнитного центра:

• Спиновая ловушка — когда целевая частица короткоживущая: супероксид, ·ОН, углеродцентрированные интермедиаты липидов.
• Спиновый зонд — когда интересует не сама частица, а среда: вязкость, текучесть мембраны, pH, кислород.
• Спиновая метка — когда нужно следить за конкретным участком биомолекулы: ковалентное пришивание задаёт точку наблюдения.

По условиям эксперимента:

• Водные растворы и суспензии клеток дают высокие диэлектрические потери — используются плоские кюветы и капилляры малого диаметра.
• Быстрая кинетика радикальных реакций — проточная или остановленного потока ячейка; медленные процессы регистрируются серией спектров с накоплением.
• Работа с живой тканью и биологическими объектами требует термостатирования: инкубация по протоколу Pfeiffer ведётся при 37 °C в течение 45 мин.

По режиму регистрации:

Мощность СВЧ подбирается ниже порога насыщения, иначе линия искажается и двойное интегрирование даёт заниженную концентрацию. Амплитуда модуляции берётся меньше ширины самой узкой компоненты спектра — иначе сверхтонкая структура смазывается и различить DMPO-OH и DMPO-OOH невозможно. Оба параметра фиксируются в скрипте методики.

Комплектация и опции

• Капилляры и плоские кюветы для водных растворов с высокими диэлектрическими потерями.
• Система температурного контроля — инкубация и измерение при физиологической температуре.
• Непрерывная проточная система — кинетика радикальных реакций в реальном времени.
• Оптический стимулятор и ртутно-ксеноновая лампа (Hamamatsu) — генерация радикалов прямо в резонаторе.
• Автосэмплер для жидких проб — серийные измерения при скрининге.
• Эталоны спиновой концентрации для количественных измерений.
• ESRStudio: скрипты пользователя, готовые методики, защищённая база данных.

Преимущества

Прямое наблюдение радикала. Хроматография и оптические методы видят продукты превращений; ЭПР регистрирует сам парамагнитный центр и по сверхтонкой структуре показывает, какой именно радикал образовался.

Разделение активных форм кислорода. Супероксид и гидроксильный радикал различаются по константам аддуктов DMPO — 1,49 мТл против набора 1,42 / 1,14 / 0,125 мТл — и поэтому регистрируются раздельно в одной пробе.

Работа с непрозрачными и гетерогенными пробами. Суспензии клеток, ткани, эмульсии сигнала не экранируют: диамагнитная матрица в спектре не проявляется.

Количественный результат. Двойное интегрирование и эталон спиновой концентрации переводят площадь сигнала в число спинов, что позволяет сравнивать серии экспериментов между собой.

Поставка, гарантия, сервис

• ЭПР-спектрометр ESR5000 (Magnettech MiniScope MS 5000) поставляет ООО «Промэнерголаб» (Москва); производитель — Bruker BioSpin GmbH.
• Комплектация под биологические задачи: капилляры и плоские кюветы, термостатирование, проточная ячейка, автосэмплер.
• Спиновые ловушки и эталоны спиновой концентрации подбираются под объект исследования.
• Стоимость, сроки поставки, пусконаладка и обучение персонала уточняются в коммерческом предложении.

Заказать

Подбор ловушки, кюветы и режима регистрации зависит от объекта — клеточная культура, ткань, модельная система. Опишите задачу в форме запроса: инженеры Промэнерголаб предложат конфигурацию прибора и состав принадлежностей.